注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)謩e配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿(mǎn)意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
L-酪氨酸甲酯TRADD Antibody米諾地爾

L-半胱氨酸酯鹽酸鹽LIN28A (D84C11) XP® Rabbit mAb二酸單甲酯鹽

L-氨酸酯鹽酸鹽GATA-4 (D3A3M) Rabbit mAb2-羥基嘧啶鹽酸鹽

甘氨酸酯鹽酸鹽DR5 Antibody2-溴-4'-(三氟甲基)酮

L-蛋氨酸酯鹽酸鹽;L-甲硫氨酸酯鹽酸鹽FLCN (D14G9) Rabbit mAb二氟酸酯

L-酪氨酸酯鹽酸鹽p27 Kip1 (SX53G8.5) Mouse mAb2-硝基三氟甲

L-天冬氨酸-β-芐酯/L-天冬氨酸-芐酯p27 Kip1 (SX53G8.5) Mouse mAb1,2-二氫-2-異丁氧基喹啉-1-甲酸異丁酯

L-谷氨酸-γ-芐酯MyD88 Antibody甲氧基酸甲酯

L-氨酸芐酯鹽酸鹽β-Actin (8H10D10) Mouse mAb2-巰基煙酸

L-脯氨酸芐酯鹽酸鹽β-Actin (8H10D10) Mouse mAb甲基-5-羥甲基咪唑鹽酸鹽

L-精氨酸-L-谷氨酸鹽TRAIL (C92B9) Rabbit mAb (PE Conjuga)5-羥甲基噻唑

L-精氨酸-α-酮戊二酸鹽（2:1）GRB10 Antibody(二甲氨基)縮二甲

S-酰半胱氨酸鹽酸Phospho-SHP-2 (Tyr580) Antibody(3AR,4R,5R,6AS)-基六氫-2-氧代-2H-環(huán)戊并[B]呋喃-5-基 [1,1'-聯(lián)]-甲酸酯

O-叔丁基-L-蘇氨酸甲酯鹽酸鹽ZO-3 (D57G7) XP® Rabbit mAb2,二氨基-5-溴吡啶

L-氨酸異酯鹽酸鹽ZO-3 (D57G7) XP® Rabbit mAb甲基-2-并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物

L-精氨酸叔丁酯TNF-α Antibody-硝

L-天冬酰甲酯鹽酸鹽JNK1 (2C6) Mouse mAb2-酸

L-天冬氨酸二叔丁基酯鹽酸鹽TGF-β (56E4) Rabbit mAb硫代嗎啉-1,1-二氧化物

低密度脂蛋白受體(LDLR)ELISA試劑盒TPA/PLAT  組織型纖溶酶原激活劑100 ul

低密度脂蛋白免疫復(fù)合物(LDL-IC)ELISA試劑盒SUZ12/CHET9  胚胎干細(xì)胞抑制蛋白Suz12100 ul

低密度脂蛋白膽固(LDL-C)ELISA試劑盒SP-A   肺表面活性蛋白A20 ul

低密度脂蛋白(LDL)ELISA試劑盒SPA-1/SIPA-1  信號(hào)感應(yīng)增殖相關(guān)蛋白1100 ul

的牛血清白蛋白殘留檢測(cè)ELISA試劑盒SPAG5/map126/Astrin  相關(guān)抗原5100 ul

蛋白酸酶(PP)ELISA試劑盒SPARC  富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白100 ul

蛋白聚糖4(PRG4)ELISA試劑盒SP-B  肺表面活性蛋白B20 ul

蛋白激酶G(PKG)ELISA試劑盒SP-D  肺表面活性蛋白D100 ul

蛋白激酶C(PKC)ELISA試劑盒Spectrin-Alpha  血影蛋白/收縮蛋白100 ul
熒光定量PCR試劑盒β-乳球蛋白抗體Myricetin中文名：楊梅素別名：分子式：C15H10O8

磷酸化β 連環(huán)素蛋白抗體Isorhamnetin中文名：異鼠李素別名：Quercetin 3'-methyl ether分子式：C16H12O7

丁酰膽堿酯酶單克隆抗體7,4'-Di-O-methylapigenin 5-O-glucoside中文名：別名：分子式：C23H24O10

BADH2抗體(稻)Chrysoeriol中文名：柯伊利素別名：金圣草黃素分子式：C16H12O6

β-酪蛋白抗體Lethedoside A中文名：別名：5-Hydroxy-3',4',7-trimethoxyflavone 5-O-glucoside分子式：C24H26O11
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。